柱壓?jiǎn)栴}在我們所熟悉的基本色譜分離方程式中，分離度R和柱效（N）、選擇（a）以及容量k’相關(guān)，和柱壓無關(guān)。 但柱壓（P）仍是HPLC方法中的重要參數(shù)之一，因?yàn)橹鶋悍从沉松V柱的狀況。
現(xiàn)今能承受400 bar壓力的HPLC泵很常見，色譜柱如在遠(yuǎn)低于上限的壓力下正常運(yùn)行，不需要我們關(guān)注；當(dāng)柱壓升高接近上限或者柱壓有異常升高，往往意味著色譜柱出狀況了，需及時(shí)進(jìn)行維護(hù)和補(bǔ)救，嚴(yán)重時(shí)色譜柱就已報(bào)廢了。本節(jié)將詳細(xì)觀察柱壓?jiǎn)栴}并提出可行的解決方案。
●K0是比深透性系數(shù)，對(duì)填充床，其值約為0.001。（通過此公式可近似計(jì)算出給定色譜條件下的理論柱壓。只有當(dāng)新柱實(shí)際測(cè)得的柱壓和理論柱壓相差很大，才能說柱壓存在問題。）
●黏度 (η)取決于流動(dòng)相溶劑的選擇，為減少柱壓，反相色譜中傾向于選擇低黏度的乙腈，而不是高黏度的異丙醇。當(dāng)然選擇時(shí)還需考慮溶劑強(qiáng)度、及性、分析物的溶解度以及和分析物兼容性等。
●柱長（L）增加分離度（R），流速（F）能加快分離，但都會(huì)導(dǎo)致柱壓上升，選擇這些運(yùn)行參數(shù)時(shí)，需綜合平衡和折中。
●填料粒徑對(duì)柱壓影響大，dp減少一被，柱壓將增加4被。UHPLC中采用的sub-2 μm填料，柱壓約過普通HPLC泵的400Bar上限很多。
●柱溫減少低黏度η，相應(yīng)減少柱壓。在梯度洗脫時(shí)，黏度隨流動(dòng)相組成的變化而改變，柱壓也會(huì)處在不斷變化中。對(duì)水/甲醇流動(dòng)相體系，在55：45時(shí)，黏度和柱壓有個(gè)值。
●內(nèi)徑的影響同樣很大，根據(jù)線流速相同柱壓相同的原則，4.6mm內(nèi)徑的色譜柱流速為1ml/min，約相當(dāng)于在2.1mm內(nèi)徑色譜柱上的0.2ml/min流速，在10mm半制備色譜柱上的5ml/min，計(jì)算公式為v＝1.0ml/min x（內(nèi)徑r/4.6）2。所以在換不同內(nèi)徑色譜柱時(shí)，請(qǐng)及時(shí)調(diào)整流速，以免因高柱壓損壞色譜系統(tǒng)。
柱壓下降的原因一般是儀器系統(tǒng)的連接有泄漏，柱壓不穩(wěn)定一般認(rèn)為是流路中有氣泡或空穴，和色譜柱相關(guān)的柱壓?jiǎn)栴}是一般都是柱壓上升。
通過觀察色譜柱基本構(gòu)造，和柱壓相關(guān)是入口端篩板（inlet frit）以及其后面1-2cm長度的柱頭填料。篩板上有比填料粒徑小的小孔，篩板上的小孔或柱頭填料的間隙被部分堵塞，是柱壓上升的主要原因。
有以下幾類情況可能導(dǎo)致這種情況：
一 、填料破碎和使用后有填料粉末生成填料破碎一般在裝柱過程中發(fā)生，裝柱壓力過大或所選硅膠機(jī)械強(qiáng)度過低所至，設(shè)定柱壓出廠標(biāo)準(zhǔn)可解決。而流動(dòng)相中高pH值緩沖鹽使硅膠溶解并重新形成填料粉末，則會(huì)堵塞出口端篩板。這種情況下反沖不起作用，只有換后篩板，不過打開承壓的后篩板，對(duì)柱床會(huì)有不好影響。
二、顆粒物堵塞引起柱壓上升和對(duì)策
可能堵塞入口端篩板（前篩板）和柱頭填料間隙的顆粒物來源有：
●樣品（制樣時(shí)灰塵和濾紙等帶入）；
●進(jìn)樣閥密封圈磨損；
●流動(dòng)相（溶劑本身含有和配制過程進(jìn)入）；
●液相儀器中泵閥密封圈的磨損；
●緩沖鹽析出（一般在梯度運(yùn)行和進(jìn)樣時(shí)鹽的溶劑環(huán)境改變導(dǎo)致）；
●水和緩沖鹽流動(dòng)相內(nèi)生長的雜質(zhì)，也是顆粒物來源的一種，可堵塞篩板和填料間隙。應(yīng)減少將這類流動(dòng)相在室溫下久放，可放入冰箱存放。
對(duì)此，我們能做的方制措施和解決辦法有：
1) 預(yù)制措施
1.過濾：樣品（標(biāo)準(zhǔn)品）和流動(dòng)相過濾，既方制了篩板、柱頭和毛細(xì)管堵塞，又能減少進(jìn)樣閥、活塞桿和截止閥等儀器關(guān)鍵部件的磨損。普通用0.45um孔徑濾膜過濾樣品和流動(dòng)相，對(duì)使用2um以下填料的高壓柱的，可用0.20um濾膜。濾膜材質(zhì)有纖維素、聚四氟乙烯、尼龍、硝酸纖維和纖維等，須根據(jù)和樣品溶劑及分析物的適應(yīng)性慎重選擇。
2.使用在線過濾器：在線過濾器內(nèi)裝有可換的濾片，濾片孔徑一般有2um和0.5um兩種。安裝位置有兩個(gè)可選擇：在進(jìn)樣器和色譜柱之間時(shí)，對(duì)樣品和流動(dòng)相中的顆粒物都有用；在泵和進(jìn)樣器之間，則只對(duì)流動(dòng)相有過濾作用。
3.使用保護(hù)柱：保護(hù)柱是縮小版的色譜柱，內(nèi)含帶填料的可換的柱芯，安裝在進(jìn)樣閥和色譜柱之間，用于色譜柱的化學(xué)污染為主，也有過濾顆粒物的作用。
2) 故障解決
1.反沖色譜柱：不連接檢測(cè)器，直接將堵在前篩板上的顆粒物沖出排到廢液瓶中。開始時(shí)反沖壓力可低于正常使用壓力，待顆粒物有沖出后，逐步?jīng)_洗壓力。有時(shí)顆粒物已嵌入到篩板里面，反沖不湊效，早反沖、勤反沖相對(duì)好。有的廠商為減少堵塞，使用了較大孔徑（2-5um）的前篩板，這種情況反沖會(huì)將填料沖出。
2.換篩板：一般不建議這樣做，因?yàn)閾Q篩板會(huì)帶走粘在篩板上的部分填料，使柱床的均一性受影響，導(dǎo)致柱效下降。不過如果反沖不能解決問題，也只能不得已而為之，要不然就要把色譜柱報(bào)廢了。3.如果系統(tǒng)中不接色譜柱，柱壓仍然高，說明泵出口到色譜柱之間的其它部位，包括進(jìn)樣器、在線過濾器和保護(hù)柱等有堵塞，可逐一排查。為了減少死體積，毛細(xì)管都做得盡可能的細(xì)，也可能被堵。
三、化學(xué)污染物引起柱壓上升和對(duì)策
來源同樣是樣品、流動(dòng)相和系統(tǒng)，不過來源于樣品的污染普遍，是對(duì)復(fù)雜基體樣品未經(jīng)前處理或前處理不夠的時(shí)候。化學(xué)污染物主要有：分子量很大的化合物、鹽類、脂質(zhì)、蠟類、油脂、腐殖酸、蛋白質(zhì)等其它生物來源的物質(zhì)。
●像鹽類這樣的保留能力小的污染物會(huì)在死體積處很快從柱中洗脫出去，檢測(cè)器一般對(duì)此類物質(zhì)響應(yīng)不大，有時(shí)表現(xiàn)為干擾峰、基線波動(dòng)、負(fù)峰。
●保留能力中等的污染物，會(huì)被慢慢清理色譜柱，表現(xiàn)為寬峰、基線饅頭形波動(dòng)和基線緩慢漂移。
●對(duì)強(qiáng)保留的污染物，一般流動(dòng)相強(qiáng)度不能將其從柱中洗出，會(huì)逐步在柱頭累積。
有時(shí)，累積在柱頭的污染物可作為新固定相對(duì)分析物起作用，引起保留時(shí)間改變、峰拖尾和峰分叉等。污染物在柱頭累積到程度，如果不采取措施，會(huì)堵塞填料間隙，引起柱壓上升。好的辦法是選用適合的溶劑沖洗溶解這些物質(zhì)，同時(shí)又不對(duì)填料本身有損害。如聚合物柱中累積的蛋白類污染物可用pH13-14的強(qiáng)堿溶液洗掉，但這種方法不適合硅膠基質(zhì)色譜柱。
1） 方制措施
1. 制樣時(shí)采用SPE固相萃取等方法，預(yù)先將色譜柱類的污染物質(zhì)清理掉；
2. 連接保護(hù)柱:
●保護(hù)柱是分析柱的延伸，在填料類型和粒徑上應(yīng)于分析柱一樣，才能大限度起保護(hù)作用，又不影響色譜性能。一個(gè)設(shè)計(jì)和裝填良好的保護(hù)柱，還可增加分析柱的分離效率。
●如果因某種原因需在保護(hù)柱中用不同的填料，也應(yīng)選擇比其所保護(hù)的分析柱保留能力弱的固定相，這時(shí)的保護(hù)柱用于截住強(qiáng)保留物質(zhì)，類似于SPE小柱。
●當(dāng)保護(hù)柱柱芯保護(hù)功能用完時(shí)，也不能說不可再清洗后復(fù)用，但價(jià)格低不值得去花這個(gè)時(shí)間。
3. 經(jīng)常對(duì)分析柱進(jìn)行沖洗維護(hù)：
●流動(dòng)相中沒有緩沖鹽:分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min
●流動(dòng)相中含有緩沖鹽:分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向沖洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易長菌，使用時(shí)間不可過3天）。
